#methodes d'etudes en histologie

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Indications d'une décalcification

[ Description déjà vue en italique - La décalcification permet de rendre le tissu plus mou pour en faciliter la coupe ensuite – sinon ça abime le rasoir du microtome. Pour cela il s'agit d'ajouter un chélateur d'ions calciums (Ca2+) qui va attirer ces derniers hors de la matrice extra-cellulaire des tissus. Cette étape a pour défaut de rendre certaines techniques infaisables et de créer des artefacts supplémentaires donc il ne faut pas faire une décalcification sur un tissu qui n'en a pas besoin. ]

Ainsi tout les tissus contenant du calcium cristallisé dans la matrice extra-cellulaire sont indiqués pour la décalcification. Citons la biopsie ostéo-médullaire (BOM) c'est-à-dire une « carotte » de moelle hématopoïétique prélevée dans la crête iliaque, les dents, et évidement tout les prélèvements osseux. On peut dans certains cas de figure se passer de la décalcification si on utilise une lame en diamant pour la coupe.

Sources illustrations : fig.241 Male pelvis / fig.72 Human bone marrow / fig.1002 Permanent teeth, right side / fig.260 Plan of ossification of the tibia / fig.73 Transverse section of compact tissue bone - par Henry Vandyke Carter pour le Gray's Anatomy

Ces schémas ont été faits pour mes ED du Tutorat à partir des cours que j'ai retranscrit quand j'étais en première année de médecine. Ma seule source est le professeur de l'époque, et je peux avoir mal compris certaines choses, faire des approximations fausses, etc même si je fais de mon mieux. Croiser les sources permet d'avoir des informations plus fiables. N'hésitez pas à commenter pour discuter des sujets abordés ! Schémas et explications faits entre 2015 et 2016.

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Indications de la congélation

La congélation est la conservation des tissus par le froid à -80°C, qui se distingue de la fixation par son caractère non-définitif, et sa rapidité à mettre en place l'observation au microscope ensuite notamment. Il y a trois indications pour congeler un prélèvement : diagnostique, sanitaire ou pour la recherche.

En effet les tissus congelés peuvent aider au diagnostique du fait de la rapidité de leurs traitement ce qui peut conditionner le geste opératoire durant une opération chirurgicale (= per-opératoire), par exemple pour savoir si l'exérèse d'une tumeur est complète ou non, mais ce résultat étant moins précis il doit être confirmé après avec une observation sur tissu fixé. Les tissus congelés peuvent servir aussi à réaliser des techniques histologiques non réalisables sur des tissus fixés comme certains cas d'immuno-histo-chimie (IHC), tout ce qui est enzymo-histo-chimie (EHC) et parfois pour étudier les acides nucléiques.

En santé publique, l'Institut National du Cancer (INCa) impose que les laboratoires conservent certains types de tumeurs par congélation, qui permet des études moléculaires plus fines que les tissus fixés. Cela a des visées diagnostiques (trouver et classer la maladie selon les mutations en jeu), théranostiques (trouver la thérapie en fonction de ces mutations), et pronostique (évaluer la survie d'un patient selon le type de mutations présentes). Cette liste évolue avec les avancées de la recherche, mais au moment où j'écris cela concerne beaucoup d'hémopathies, des sarcomes, les tumeurs cérébrales et pédiatriques. On parle de tumorothèques ou de banques de tissus.

Enfin les tissus peuvent être conservés pour des laboratoires de recherche, notamment lorsqu'il s'agit de tumeurs rares. Après il existe d'autres indications plus spécifiques, pour réaliser des techniques impossibles sur des tissus fixés comme l'immuno-histo-chimie sur les coupes de muscles striés squelettiques.

Mais la congélation a plusieurs défauts : les études morphologiques sont médiocres et moins bonnes que sur les tissus fixés et inclus en paraffine car le froid déforme les tissus et la coupe est plus grossière, ce qui fait que pour un prélèvement il y a toujours une coupe qui n'est pas congelée mais fixée pour mieux analyser la morphologie des tissus ensuite. Autre inconvénient c'est que les tissus congelés ont besoin d'être conservés dans des réfrigérateurs spécifiques : c'est du matériel qui coûte cher, qui est gourmand en énergie et qui est difficile à entretenir (sans parler des problèmes s'il y a une panne). Ainsi pour y économiser de la place, on ne congèle un prélèvement que si c'est indiqué et qu'on n'a pas le choix.

Ces schémas ont été faits pour mes ED du Tutorat à partir des cours que j'ai retranscrit quand j'étais en première année de médecine. Ma seule source est le professeur de l'époque, et je peux avoir mal compris certaines choses, faire des approximations fausses, etc même si je fais de mon mieux. Croiser les sources permet d'avoir des informations plus fiables. N'hésitez pas à commenter pour discuter des sujets abordés ! Schémas et explications faits entre 2015 et 2016.

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Fabrication des anticorps, IHC

D'abord un épitope, c'est-à-dire une partie d'un antigène (Ag) sur un corps étranger, est reconnu par une cellule présentatrice d'antigène (CPA) du système immunitaire par exemple un macrophage. Cet épitope va être présenté à un plasmocyte qui va se mettre alors à synthétiser des anticorps (Ac), tous dirigés contre l'épitope reçu. Les anticorps vont alors se fixer sur les épitopes, formant des complexes anticorps-antigène qui neutralisent le corps étranger.

Les buts de l'immuno-histo-chimie (IHC) vont être d'une part d'exploiter la machinerie cellulaire pour fabriquer des anticorps in vitro et dirigés contre des épitopes choisis à travers des sérums polyclonaux ou monoclonaux, et d'autre part de visualiser le complexe anticorps-antigène pour localiser l'épitope voulu ce qui se fait grâce à des traceurs divers. Ainsi les anticorps peuvent être utilisés comme réactifs de laboratoire pour mettre en évidence tel ou tel épitope.

Source illustrations : anticorps par D. Goodsell pour Molecule of the Month - http://pdb101.rcsb.org/motm/21 / cadhérine par D. Goodsell pour Molecule of the Month - http://pdb101.rcsb.org/motm/99

Source photos : plasmocyte - http://imagesbiogeolfxm.free.fr/immuno/original/plasmocyte%20MET.jpg / cellule dendritique - https://pathbio.med.upenn.edu/pbr/portal/cell/e40_dendr_med_full.jpg

Ces schémas ont été faits pour mes ED du Tutorat à partir des cours que j'ai retranscrit quand j'étais en première année de médecine. Ma seule source est le professeur de l'époque, et je peux avoir mal compris certaines choses, faire des approximations fausses, etc même si je fais de mon mieux. Croiser les sources permet d'avoir des informations plus fiables. N'hésitez pas à commenter pour discuter des sujets abordés ! Schémas et explications faits entre 2015 et 2016.

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Anticorps et antigènes

Un anticorps est une glycoprotéine de la famille des immunoglobulines, un tétramère formée de deux chaines lourdes et deux chaines légères. En forme de -Y, il a une partie commune à tout les anticorps d'un même individu (donc différent d'un individu à l'autre et à fortiori d'une espèce à l'autre), et deux sites de reconnaissances identiques et qui reconnaissent le même épitope. Ces protéines sont fabriquées par un type de cellule appartenant au système immunitaire, le plasmocyte. Chaque plasmocyte synthétise un seul et unique type d'anticorps, qui seront dirigés tous vers le même épitope.

Un antigène est une molécule – souvent protéique mais pas forcément – qui se trouve sur un corps reconnu comme étant étranger par un globule blanc : ça peut être par exemple une protéine membranaire de bactérie. Un antigène possède plusieurs épitopes, c'est-à-dire des régions qui peuvent être reconnues par un anticorps et pour un antigène on peut avoir plusieurs anticorps. Les épitopes peuvent être reconnus par d'autres cellules du système immunitaire, pour reconnaître à échelle moléculaire les corps étrangers et construire une défense contre.

Source illustrations : anticorps par D. Goodsell pour Molecule of the Month - http://pdb101.rcsb.org/motm/21 / cadhérine par D. Goodsell pour Molecule of the Month - http://pdb101.rcsb.org/motm/99

Source photos : plasmocyte - http://imagesbiogeolfxm.free.fr/immuno/original/plasmocyte%20MET.jpg / cellule dendritique - https://pathbio.med.upenn.edu/pbr/portal/cell/e40_dendr_med_full.jpg

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Coloration PAS-diastase

La coloration à l'acide périodique de Schiff (PAS) permet de mettre en évidence les structure glucidiques comme le glycogène, les glycosaminoglycanes et les protéoglycanes, les mucines qui sont hautement glycosylées, et les lames basales qui contiennent des glycosaminoglycanes. Comme cette coloration ne met rien d'autre à évidence, on utilise avec de l'hématéine un colorant basique bleu qui permet de mettre un peu de contraste sur les tissus et colore notamment les acides nucléiques en bleu.

La diastase est une enzyme qui digère le glycogène. Pour mettre en évidence le glycogène il suffit alors de prendre deux coupes proches d'un même prélèvement, de garder la première comme coupe témoin avec du PAS uniquement, et d'appliquer du PAS et de la diastase sur la seconde : si des zones colorées au PAS sur le témoin disparaissent sur la deuxième coupe, alors c'est qu'il y avait du collagène. Ça peut aider à diagnostiquer les glycogénoses, maladies de surcharge intra-cellulaire de glycogène.

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Champs de compétence HIS / IHC

L'hybridation in situ (HIS) met en évidence des acides nucléiques grâce à une sonde traçable et complémentaire à une séquence ADN ou ARN choisie. L'immuno-histo-chimie (IHC) met en évidence des  protéines grâce à un anticorps traçable et qui reconnaît spécifiquement des éléments localisés sur les antigènes (souvent protéiques) appelées épitopes.

Ainsi les techniques d'HIS ne permettent de mettre en évidence que le génome et le transcriptome, alors que le les techniques d'IHC permettent de ne voir que le protéinome. Par exemple si je veux savoir si une cellule pancréatique sécrète bien de l'insuline, je peux chercher à détecter directement l'insuline par IHC, ou chercher l'ARN messager (ARNm) qui code pour l'insuline.

Ces schémas ont été faits pour mes ED du Tutorat à partir des cours que j'ai retranscrit quand j'étais en première année de médecine. Ma seule source est le professeur de l'époque, et je peux avoir mal compris certaines choses, faire des approximations fausses, etc même si je fais de mon mieux. Croiser les sources permet d'avoir des informations plus fiables. N'hésitez pas à commenter pour discuter des sujets abordés ! Schémas et explications faits entre 2015 et 2016.

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Accessibilité de l'antigène

L'antigène peut être plus ou moins accessible par les anticorps selon sa situation, et cela à plusieurs échelles. Comme un prélèvement tissulaire (donc une étude histologique) contient des éléments de la matrice extra-cellulaire (MEC) les anticorps auront du mal à passer au travers, alors que dans les prélèvements cytologiques il n'y a pas de MEC ce qui permet aux anticorps de circuler et d'atteindre plus facilement les antigènes. �� échelle cellulaire, l'anticorps aura plus de mal à atteindre un antigène intra-cellulaire plutôt qu'extra-cellulaire car la membrane plasmique n'est pas une barrière perméables à de si grosses protéines que sont les anticorps. À échelle moléculaire, l'encombrement stérique – c'est-à-dire selon la conformation et selon les autres molécules autours de l'épitope – influe aussi sur l'accessibilité pour l'anticorps.

Enfin les techniques de préparation du prélèvement influent aussi sur cette accessibilité. Cette dernière est très bonne sur les tissus congelés, moyenne pour les cellules apposées (surtout si l'antigène est intracellulaire auquel cas il faudra perméabiliser la membrane), et mauvaise pour les tissus fixés et inclus en paraffines. Or c'est cette dernière configuration qui est la plus utilisée car offre une très bonne morphologie et coute moins cher que la congélation : une étape dite de démasquage antigénique, qui permet d'améliorer l'accessibilité à l'antigène, est systématique pour faire de l'immuno-histo-chimie sur tissus fixés et inclus.

Source illustrations : anticorps par D. Goodsell pour Molecule of the Month - http://pdb101.rcsb.org/motm/21 / cadhérine par D. Goodsell pour Molecule of the Month - http://pdb101.rcsb.org/motm/99

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Comparaison de sérums mono et polyclonaux

Les buts de l'immuno-histo-chimie (IHC) vont être d'une part d'exploiter la machinerie cellulaire pour fabriquer des anticorps in vitro et dirigés contre des épitopes choisis à travers des sérums polyclonaux ou monoclonaux, et d'autre part de visualiser les complexes anticorps-antigène pour localiser l'épitope voulu ce qui se fait grâce à des traceurs divers. Ainsi les anticorps peuvent être utilisés comme réactifs de laboratoire pour mettre en évidence tel ou tel épitope.

Les sérums poly- et monoclonaux ont chacun leurs avantages et inconvénients directement liés à leurs modes de fabrication, et sont plus ou moins en miroir entre les deux catégories. La puissance du signal pour un même antigène est plus forte si le sérum est polyclonal car plusieurs épitopes sont marqués par un anticorps, alors qu'un seul épitope est marqué par définition si le sérum est monoclonal. En revanche ce signal est moins spécifique dans un sérum polyclonal : du fait que les épitopes peuvent se trouver sur plusieurs antigènes, plus on a d'anticorps pour des épitopes différents et plus il y a de chance que ces anticorps aillent ailleurs que sur l'antigène voulu.

Ensuite il y a des problèmes liés au sacrifice de l'animal – outre le côté éthique. Quand on sacrifie un animal pour obtenir le sérum de son sang, il est mort et donc ne fabrique plus d'anticorps donc on en a une quantité très limitée. Inversement, grâce aux hybridomes immortels des sérums monoclonaux, une quantité illimitée d'anticorps est disponible. Il y a aussi un soucis de reproductibilité lié à ça, puisque pour obtenir un deuxième sérum polyclonal une fois le premier épuisé, il faut sacrifier un autre animal ; or tout les organismes sont différents et les anticorps produits aussi du fait de la complexité du système immunitaire : il peut donc y avoir des différences d'efficacité entre des sérums polyclonaux dirigés contre un même antigène mais extraits de deux animaux différents. Ce problème encore une fois n'existe pas pour les sérum monoclonaux puisqu'il n'y a qu'un seul sacrifice, le premier qui sert à obtenir les hybridomes.

Ces schémas ont été faits pour mes ED du Tutorat à partir des cours que j'ai retranscrit quand j'étais en première année de médecine. Ma seule source est le professeur de l'époque, et je peux avoir mal compris certaines choses, faire des approximations fausses, etc même si je fais de mon mieux. Croiser les sources permet d'avoir des informations plus fiables. N'hésitez pas à commenter pour discuter des sujets abordés ! Schémas et explications faits entre 2015 et 2016.

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Production de sérum polyclonal

Les buts de l'immuno-histo-chimie (IHC) vont être d'une part d'exploiter la machinerie cellulaire pour fabriquer des anticorps in vitro et dirigés contre des épitopes choisis à travers des sérums polyclonaux ou monoclonaux, et d'autre part de visualiser les complexes anticorps-antigène pour localiser l'épitope voulu ce qui se fait grâce à des traceurs divers. Ainsi les anticorps peuvent être utilisés comme réactifs de laboratoire pour mettre en évidence tel ou tel épitope.

Pour créer un sérum polyclonal, il faut injecter des doses de l'antigène à cibler dans un animal de laboratoire sur plusieurs semaines, ce qui permet une fabrication naturelle de plasmocytes et d'anticorps dirigés contre tous les épitopes de l'antigène injecté. L'animal est sacrifié et son sang prélevé puis centrifugé. Le culot contient les cellules et le surnageant le sérum, où se trouvent les anticorps.

Ce sérum contient plusieurs clones de plusieurs anticorps – par abus de langage on parle de sérum polyclonal mais il serait plus exact de parler d'anticorps polyclonaux. On peut avoir dans le mélange plusieurs anticorps dirigés contre un seul épitope mais avec des affinités différentes, et on peut avoir plus épitopes ainsi visés.

Source illustrations : anticorps par D. Goodsell pour Molecule of the Month - http://pdb101.rcsb.org/motm/21 / cadhérine par D. Goodsell pour Molecule of the Month - http://pdb101.rcsb.org/motm/99

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Inclusion : étape automatique

L'inclusion d'un prélèvement a pour but de rendre un tissu ferme pour pouvoir le couper en fine lamelle observable au microscope. Le milieu d'inclusion est la paraffine, un hydrocarbure liquide à 56°C et solide à température ambiante. Les premières étapes de l'inclusion sont faites par un automate, puis les étapes d'enrobage et démoulage sont manuelles. Les trois premières étapes automatiques sont la déshydratation, la clarification et l'imprégnation. Un automate peut gérer plusieurs prélèvements à la fois en quelques heures.

La déshydratation consiste à tremper le prélèvement, sélectionné et mit dans une cassette, dans plusieurs bains d'alcools afin d'éliminer le fixateur. La clarification consiste à le tremper ensuite dans des bains de solvants comme le toluène ou le xylène afin d'éliminer l'éthanol de la déshydratation. L'inconvénient est que les lipides parfois contenus dans les tissus sont aussi dissouts par les solvants : ainsi comme la fixation induit indirectement cette étape de clarification, les études sur les inclusions lipidiques doivent se faire sur tissus frais (non fixés) ; sinon il ne reste que des « lumières », des trous dans la coupe là où se trouvaient avant les lipides. Enfin l'imprégnation consiste à tremper le prélèvement dans un bain de paraffine liquide – et donc chauffée à 57°C – afin que la paraffine diffuse dans les tissus avant de l'inclure dans un bloc de paraffine solide aux prochaines étapes.

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EHC et typage musculaire

L'enzymo-histo-chimie (EHC) est une technique qui permet de révéler que tel enzyme est fonctionnelle dans telle cellule, en appliquant sur une coupe un substrat de cette enzyme qui se colore au contact de celle-ci. Cela implique évidemment que le prélèvement ne soit pas fixé, puisque la fixation dénature les enzymes.

On s'en sert notamment pour différencier des populations cellulaires qui sont morphologiquement identiques mais dont le contenu enzymatique est différent, comme les sous-types de rhabdomyocytes (les cellules des muscles striés squelettiques). Ainsi si le rhabdomyocyte se colore au succinate-déshydroégnase alors il est de type 1 (aérobie), et s'il se colore aux ATPases basiques alors il est de type 2b (anaérobie).

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Décalcification

La décalcification permet de rendre le tissu plus mou pour en faciliter la coupe ensuite – sinon ça abime le rasoir du microtome. Pour cela il s'agit d'ajouter un chélateur d'ions calciums (Ca2+) comme l'EDTA ou le citrate qui va attirer les ions hors de la matrice extra-cellulaire des tissus osseux par exemple. Ce procédé est accéléré par la chaleur ou l'électrolyse.

Cette étape est après la macroscopie, parce qu'on ne va pas décalcifier tout le prélèvement si c'est pour en utiliser qu'un morceau, et avant l'inclusion sinon le calcium ne serait plus accessible par les chélateurs. Elle a pour défaut de rendre certaines techniques infaisables et de créer des artefacts supplémentaires donc il ne faut pas faire une décalcification sur un tissu qui n'en a pas besoin.

Ces schémas ont été faits pour mes ED du Tutorat à partir des cours que j'ai retranscrit quand j'étais en première année de médecine. Ma seule source est le professeur de l'époque, et je peux avoir mal compris certaines choses, faire des approximations fausses, etc même si je fais de mon mieux. Croiser les sources permet d'avoir des informations plus fiables. N'hésitez pas à commenter pour discuter des sujets abordés ! Schémas et explications faits entre 2015 et 2016.

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Exemples de fixateurs

Les fixateurs permettent la conservation des tissus. Les fixateurs purs sont peu utilisés par les professionnels, qui préfèrent les mélanges. En fixateurs purs citons l'éthanol, l'acétone, le formol, l'acide acétique, l'acide tri-choloro (3Cl) acétique et l'acide picrique (les couleurs servent de légende pour les mélanges ensuite). L'acide picrique a la particularité de colorer en jaune fluo, ce qui rend les techniques utilisant la fluorescence non-interprétables et donc les mélanges à base d'acide picrique comme le liquide de Bouin sont de moins en moins utilisés.

Le liquide de Bouin est un mélange d'acide picrique, de formol, d'acide acétique et d'eau. Il a été longtemps utilisé en France et certains laboratoires l'utilisent encore pour cela mais l'acide picrique qu'il contient est un désavantage aujourd'hui où des techniques comme l'immuno-fluorescence ou l'hybridation in situ deviennent  assez courantes. L'AFAA, pour alcool – formol – acide acétique, n'est pas fluorescent et donc permet ces techniques en plus d'être aussi bon pour la morphologie, mais ne permet pas l'étude des acides nucléiques (ADN/ARN). Enfin, le formol neutre tamponné (paraformaldéhyde 4 % à pH7) est le fixateur le plus utilisé et il est compatible aux études ADN/ARN.

Tout ces fixateurs préparent pour des coupes à observer au microscope optique : le microscope électronique (ME) nécessite des fixateurs spécifiques que sont le glutaraldéhyde, puis le tétroxyde d'osmium.

En bref, le choix du fixateur va dépendre de l'étude à réaliser sur la coupe puisque tout les fixateur ne sont pas compatibles avec toutes les techniques.

Ces schémas ont été faits pour mes ED du Tutorat à partir des cours que j'ai retranscrit quand j'étais en première année de médecine. Ma seule source est le professeur de l'époque, et je peux avoir mal compris certaines choses, faire des approximations fausses, etc même si je fais de mon mieux. Croiser les sources permet d'avoir des informations plus fiables. N'hésitez pas à commenter pour discuter des sujets abordés ! Schémas et explications faits entre 2015 et 2016.

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Pouvoirs séparateur selon les microscopes

Le pouvoir séparateur, ou puissance de résolution, désigne la distance minimale séparant deux points individualisables lorsqu'on les observe. Cette variable détermine ainsi la précision avec laquelle on peut observer un petit objet selon l'outil.

L'oeil a ainsi une puissance de résolution de 0,2 millimètres (mm) c'est-à-dire qu'il n'arrive pas à distinguer des choses plus petites. À l'oeil nu on peut observer les organes, les biopsies ou les amas cellulaires : on appelle cela la macroscopie. Au microscope les images sont agrandies et les détails séparés. Au microscope optique le pouvoir séparateur descend jusqu'à 0,2 micromètres (µm) ce qui permet de voir les cellules, les bactéries et les plus gros organites comme les noyaux ou les mitochondries. Enfin le microscope électronique va jusque 0,2 nanomètres (nm) ce qui permet de voir les molécules , les virus, et les plus petits organites.

Source photos : ME : http://img.directindustry.fr/images_di/photo-g/30506-2859847.jpg / MO : http://www.conrad.fr/medias/global/ce/4000_4999/4200/4210/4215/096752_LB_00_FB.EPS_1000.jpg

Source illustration : fig.1205 Front of left eye with eyelids separated to show medial canthus par Henry Vandyke Carter pour le Gray's Anatomy

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Traitement des coupes semi-fines et ultra-fines

Gérer un prélèvement dans le but de l'observer au microscope électronique (ME) est différent que pour un microscope optique (MO), car ce ne sont pas les mêmes principes pour l'observation, ni la même épaisseur de coupe qui doit être plus fine pour le ME. Selon les lames de rasoir sur l'ultra-microtome, l'épaisseur des coupes change : on obtient des coupes dites semi-fines avec une lame de verre, et des coupes ultra-fines avec une lame de diamant.

La coupe semi-fine, d'un micromètre (µm) d'épaisseur, est colorée au bleu de toluidine, puis le prélèvement est monté sur une lame de verre pour être observé au MO. Son interprétation va servir à sélectionner une plus petite zone à observer ensuite au ME sur la coupe ultra-fine.

La coupe ultra-fine, entre un demi-nanomètre et un demi-micromètre d'épaisseur, est manipulée sur une grille de récupération pour ne pas l'abimer ou bêtement la perdre, et ne va pas être coloré. En effet les colorants absorbent les photons du MO pour faire du contraste ; or le ME n'utilise pas des photons mais des électrons et donc les agents de contrastes doivent pouvoir absorber des électrons cette fois. C'est pourquoi on utilise des métaux lourds comme des sels de plomb ou de l'uranium. La coupe est ensuite montée, toujours avec sa grille, via deux supports : un d'observation pour la machine, et un d'archivage pour stocker le prélèvement.

Source photos : grille de métal pour ME Dutscher : http://www.dutscher.com/images/zoom/0D-12-37.jpg / microscope électronique par le Pr. P. Dubus, Méthodes d'études en histologie pour U-Bordeaux 2014-2015

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Traitement d'un prélèvement pour une observation au ME

Gérer un prélèvement dans le but de l'observer au microscope électronique (ME) est différent que pour un microscope optique (MO), car ce ne sont pas les mêmes principes pour l'observation, ni la même épaisseur de coupe qui doit être plus fine pour le ME.

Sur la macroscopie à l'état frais, on sélectionne une partie du prélèvement à observer qu'on va mettre dans une cassette, différente que pour les tissus fixés car plus petite et cubique (1mm d'arrête ; d'ailleurs c'est pas la bonne photo mais on fait avec ce qu'on a). La fixation se fait ensuite par immersion avec des fixateurs propre à ce protocole : il y a d'abord plusieurs bains pendant 1h dans du glutaraldéhyde, puis plusieurs bains pendant 24h dans de l'acide osmique. L'inclusion se fait ensuite avec de la résine époxy, une substance plus rigide que la paraffine ce qui permet ensuite de faire des coupes plus fines.

Les coupes sont ici appelées micro-coupes, et faites avec un ultra-microtome (à opposer au simple microtome utilisé pour les tissus inclus en paraffine). On peut changer les lames de ce dernier : plus la lame est dure et plus la coupe est fine : ainsi on obtient des coupes dites semi-fines avec une lame de verre, et des coupes ultra-fines avec une lame de diamant.

Source photo : cassette macroset Dutscher : http://www.dutscher.com/images/zoom/0D-12-21.jpg / ultra-microtome par le Pr. P. Dubus, Méthodes d'études en histologie pour U-Bordeaux 2014-2015

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