#timothy huang | Explore Tumblr posts and blogs

consultatiiladomiciliu-ro · 1 month ago

Text

Efectele albastrului de metilen asupra neuronilor in atacul cerebral ischemic

Citeste articolul pe https://consultatiiladomiciliu.ro/efectele-albastrului-de-metilen-asupra-neuronilor-in-atacul-cerebral-ischemic/

Efectele albastrului de metilen asupra neuronilor in atacul cerebral ischemic

Titlul original al articolului este Efectele albastrului de metilen asupra autofagiei și apoptoza în țesutul normal definit prin RMN, Penumbra ischemică și miezul ischemic.

Ceea ce inseamna: cum albastrul de metilen recupereaza neuronii afectati de accidentul vascular ischemic.

AUTORI: Zhao Jiang 1,2 , Lora Talley Watts 2 , Shiliang Huang 2 , Qiang Shen 2 , Pavel Rodriguez 2 , Chunhua Chen 1,3 , Changman Zhou 1 , Timothy Q. Duong 2 * 1 Department of Anatomy and Embryology, Peking University Health Science Center, Beijing, China, 2 Research Imaging Institute, University of Texas Health Science Center at San Antonio, San Antonio, Texas, United States of America, 3 Department of Anesthesiology and Critical Care, Perelman School of Medicine, University of Pennsylvania, Philadelphia, Pennsylvania, United States of America

Abstract

Albastrul de metilen (MB) USP, care are proprietăți de îmbunătățire a energiei și antioxidante, este utilizat în mod curent pentru a trata methemoglobinemia și otrăvirea cu cianuri la oameni. Noi recent a arătat că administrarea de Albastru de metilen reduce volumul infarctului și deficitele comportamentale la modelele de șobolani de accident vascular cerebral ischemic și leziuni cerebrale traumatice. Acest studiu raportează moleculara de bază Mecanisme de neuroprotecție Albastru de metilen în urma accidentului vascular cerebral ischemic tranzitoriu la șobolani. Sobolanii erau supus unui accident vascular cerebral ischemic tranzitoriu (60 de minute). RMN multimodal în faza acută iar la 24 de ore au fost folosite pentru a defini trei regiuni de interes (ROI): i) perfuzia-difuzia nepotrivire salvată prin reperfuzie, ii) nepotrivirea perfuzie-difuzie nesalvată de reperfuzie și iii) miezul ischemic. Țesuturile din aceste ROI au fost extrase pentru western analize ern blot ale markerilor autofagici și apoptotici.

Principalele constatări au fost:

1) Albastru de metilen tratamentul a redus volumul infarctului și deficitele comportamentale,

2) Albastru de metilen a îmbunătățit sângele cerebral curge la țesutul nepotrivire perfuzie-difuzie după reperfuzie și minimizat dăunător hiperperfuzie la 24 de ore după accident vascular cerebral,

3) Albastru de metilen a inhibat apoptoza și a crescut autofagia în nepotrivirea perfuziei-difuzie,

4) Albastru de metilen a inhibat cascadele de semnalizare apoptotică (p53-Bax- Bcl2-Caspase3) și

5) cascade de semnalizare autofagică îmbunătățite Albastru de metilen (p53-AMPK-TSC2- mTOR).

MB a indus neuroprotecția, cel puțin parțial, prin îmbunătățirea autofagiei și reducerea apoptoza în țesutul nepotrivire perfuzie-difuzie după accident vascular cerebral ischemic. Introducere Accidentul vascular cerebral este o cauză principală de deces și invaliditate pe termen lung [1]. În urma unei leziuni cerebrale ischemice, cascada apoptotică este activată în câteva ore și culminează cu moartea progresivă a celulelor în infarctul ischemic în expansiune prin proteine din familiile Bcl-2 și caspaze [2]. Classi în mod specific, ischemia cerebrală crește expresia p53 și genele din aval, inclusiv Bax [3], a membru pro-apoptotic al familiei de proteine Bcl-2 [4]. Bax se translocă în mitocondrii și induce eliberarea citocromului c din mitocondrii în citosol unde interacționează cu factorul de activare a proteazei apoptotice 1 (Apaf-1) pentru a activa caspaza-9. Activarea caspase-9 activează, la rândul său, caspazele din aval, cum ar fi caspaza-3, care în cele din urmă duce la apo- moartea celulelor ptotice [4]. De asemenea, este activată autofagia, responsabilă de degradarea și reciclarea componentelor celulare vatat în urma unei injurii ischemice [5]. Deși importanța autofagiei în diverse bio- proceselor logice și patologice este larg acceptat [6], rolul autofagiei în neuron Supraviețuirea după ischemia cerebrală acută este mai puțin înțeleasă. Există dovezi că autofagia contribuie la efectul protector în ischemia cerebrală [7] și este reglementată de multe diferite molecule precum p53, protein kinaza activată de AMP (AMPK), complexul de scleroză tuberoasă 2 (TSC2) și ținta mamiferelor a rapamicinei (mTOR), prin căi multiple de semnalizare- căi [7–9]. Multe medicamente au încercat să țintească aceste molecule (apoptotice și autofagice). căi de reducere a leziunilor cerebrale ischemice. Albastrul de metilen (MB) USP este un medicament aprobat de FDA care este utilizat în siguranță pentru a trata meta- moglobinemie și otrăvire cu cianuri la om [10]. Albastru de metilen traversează cu ușurință bara sânge-creier- mai ridicat și are atât proprietăți de îmbunătățire a energiei, cât și proprietăți antioxidante. Albastru de metilen acționează ca un ciclor de electroni [10] care permite Albastru de metilen să redirecționeze electronii către lanțul de transport de electroni mitocondrial (în absența oxigenului), susținând sau sporind astfel producția de ATP și promovând supraviețuirea celulară. Ocolind activitatea complexului I-III pentru a genera ATP, Albastru de metilen reduce, de asemenea, producerea de specii de gene din lanțul de transport de electroni mitocondrial [11], care are potențialul de a minimiza leziunile ischemice și de reperfuzie. Recent s-a demonstrat că Albastru de metilen se reduce tulburări de comportament în modelele animale ale bolii Parkinson [10], bolii Alzheimer [12,13] și pentru a reduce tulburările comportamentale și volumul leziunilor în leziuni cerebrale traumatice [14]. Am arătat recent că administrarea de Albastru de metilen a redus volumul infarctului definit de RMN și Deficiențe comportamentale într-un model de șobolan de accident vascular cerebral ischemic prin ocluzia arterei cerebrale medii (MCAO) [15]. În acest studiu, am testat mecanismele moleculare de bază ale neuroprotecției Albastru de metilen în urma accidentului vascular cerebral ischemic tranzitoriu utilizând analiza Western blot a apoptotic și autofafic cascade în diferite regiuni de interes (ROI) definite prin RMN multimodal. Utilizarea combinată RMN-ul de difuzie și perfuzie [16,17] a permis delimitarea „mis-ului de perfuzie-difuzie potrivire” (care aproximează „penumbra ischemică”) și nucleul ischemic pentru histologic analiză. Cele trei ROI au fost selectate pentru Western blot folosind RMN multimodal: i) per- nepotrivire fuziune-difuzie (țesut cu risc) salvat prin reperfuzie, ii) perfuzie-difuzie nepotrivirea nerecuperată prin reperfuzie și iii) miezul ischemic. Comparații ale western blot analiza a fost facute cu scoruri comportamentale (scoruri neurologice și analiza defectelor piciorului). Țesuturi din aceste ROI au fost extrase pentru analize western blot ale markerilor autofagici și apoptotici. Aceste descoperiri aruncă lumină asupra mecanismelor moleculare de bază implicate în neuropro- tection in urma unui accident vascular cerebral ischemic tranzitoriu.

Materiale și metode Design experiment

Toate procedurile experimentale au fost aprobate de Institutional Animal Care and Use Com- mijloc la Universitatea din Texas Health Science Center din San Antonio. Puncte finale umane au fost folosite pentru aceste animale. Criteriile au fost: la sfârșitul momentelor selectate, orice animal a suferit o pierdere în greutate de 20% sau orice animal care a suferit dureri care nu sunt controlabile prin anal faţă Au fost utilizate criterii suplimentare în consultare cu un medic veterinar, după caz. Animalele anesteziate vor fi eutanasiate printr-o supradoză de pentobarbital urmată de luxație cervicală.

Șobolani masculi Sprague-Dawley (280-320g, n = 25, Charles River Laboratories, Wilmington, MA) au fost randomizați în trei grupuri: i) chirurgie simulată (n = 5), ii) tranzitorie (60 minute) MCAO tratat cu 1 mg/kg USP Albastru de metilen (American Regent, Shirley, NY) (n = 10, 5 șobolani au fost utilizați pentru RMN și analiză Western blot, un alt grup de 5 șobolani a fost utilizat pentru testarea comportamentală) și iii) MCAO tranzitoriu (60 minute) tratat cu vehicul salin (n = 10, 5 șobolani au fost utilizați pentru RMN și Analiza Western blot, un alt grup de șobolani 5 a fost utilizat pentru testarea comportamentală). Rețineți că patru animalele, neincluse în grupurile de mai sus, au fost excluse din cauza complicațiilor chirurgicale sau moartea matură și un animal a fost exclus din cauza absenței accidentului vascular cerebral. Animalele au fost intubate și ventilate mecanic sub izofluran (2% în aerul camerei). Vena cozii a fost cateterizată. MCAO a fost obținut prin introducerea unui frec intraluminal de silicon filament acoperit cu ber (Doccol Corporation, Sharon, MA) prin artera carotidă externă în a moda retrogradă [15]. Animalele au fost apoi asigurate în decubit dorsal folosind un obicei căști stereotaxice compatibile cu RMN. După măsurarea inițială RMN la 30 de minute după debutul accidentului vascular cerebral, vehiculul (soluție salină) sau Albastru de metilen a fost perfuzat prin vena cozii timp de 30 de minute folosind un RMN pompă compatibilă (aparatul Harvard). Albastru de metilen sau vehiculul a fost administrat la 30 de minute după inducere. de MCAO dar înainte de reperfuzie care a fost la 60 de minute. Acum este revizuită. Doze suplimentare de vehicul sau Albastru de metilen au fost administrate la 6 ore (1 mg/kg, i.p.) și 15 ore (1 mg/kg, i.p.) după MCAO. Un Studiul anterior a arătat că timpul de înjumătățire al Albastru de metilen este de aproximativ 5,0-6,5 ore [18]. CO de sfârșit de maree 2 (2,8– 3,6%), temperatura rectală (36,5–37,5°C), ritm cardiac (340-450 bpm) și oxigenarea arterială urația (92–97% pentru grupul de vehicule și 93–98% pentru grupul MB) au fost înregistrate și menținute în intervalul fiziologic normal în timpul RMN.

Experimente RMN

RMN a fost efectuat pe un scaner Bruker Biospec 7T/40cm cu un gradient BGA12S de 76G/cm insert (Billerica, MA) folosind o bobină de suprafață personalizată pentru imagistica creierului și o bobină de gât pentru etichetarea perfuziei [15]. Fluxul sanguin cerebral (CBF) a fost măsurat folosind arterială continuă Tehnica de etichetare prin spin cu imagini eco-planare în gradient. Durata de etichetare a fost de 2,7 s și întârzierea după etichetare a fost de 250 ms. Coeficientul de difuzie aparent (ADC) a fost măsurat folosind Imagini eco-planare ponderate prin difuzie spin-echo cu gradienți aplicați separat de-a lungul direcțiile x, y sau z. Două valori b de 4 și 1.200s/mm 2 au fost folosite. Alți parametri RMN au fost: o singură fotografie, matrice = 96×96 (reconstituită la 128×128), câmp vizual = 25,6×25,6 mm, șapte Felii groase de 1,5 mm, unghi de răsucire de 90°, timp de repetiție = 3s, timp de ecou = 10,2 ms pentru CBF și 30 ms pentru ADC. Hărțile ADC și CBF au fost obținute la 30 și 90 de minute după ocluzie și la 24 de ore. T 2 hărțile au fost, de asemenea, achiziționate pe 24 de ore folosind ecou de rotire rapidă cu patru timpi efectivi de ecou (25, 40, 75 și 120 ms), lungimea trenului de ecou 8 și 8 medii ale semnalului. Imaginile de la fiecare șobolan în momente diferite au fost co-înregistrate. ADC, CBF și T 2 hărți au fost calculate. Volumul inițial al leziunii a fost definit de leziunea ADC la 30 de minute după accident vascular cerebral folosind pragul stabilit (0,53 × 10 -3 mm 2 /s) [19]. Un prag de 0,30 ml/g/min a fost utilizat pentru măsurarea volumului anormal al țesutului CBF. Nepotrivirea perfuzie-difuzie este țesutul cu ADC normal sau aproape de normal, dar mai mic de 0,30 ml/g/min CBF. Volumul final al infarctului ume a fost definit de T 2 la 24 de ore folosind pragul mediei T 2 valoare plus de două ori valoarea standardului abaterea dard [15]. Volumul infarctului corectat de edem a fost calculat [15]. Trei ROI au fost alese pentru analiza Western blot și aceste ROI au fost determinate pe baza ADC și CBF RMN la 30 de minute și T 2 RMN la 24 de ore după AVC. Aceste ROI au fost: ROI-A a fost perfuzia zona de nepotrivire de difuzie salvată prin reperfuzie, ROI-B a fost nepotrivirea perfuzie-difuzie zona nesalvată prin reperfuzie, iar ROI-C a fost nucleul ischemic atât cu perfuzie cât și anomalii de difuzie. Aceste definiții au fost aplicate la 30 de minute după MCAO pentru a defini fiecare regiune.

Deficiențe neurologice

Scorurile neurologice Garcia [20] au fost analizate în mod orb la 24 de ore. Vina piciorului testul a fost efectuat cu 1-3 zile înainte de MCAO și din nou 2 zile după MCAO. Sfatul a fost dat pe o podea cu grilă ridicată (dimensiune 18×11 inci cu deschideri pentru grilă de ~1,56 inci 2 și 1 in 2 ) și video înregistrat timp de cinci minute sau până când s-au făcut 50 de pași cu un membru (neafectat) [14]. Procentul de defecte ale piciorului pentru fiecare membru a fost calculat ca număr de membru anterior drept sau stâng defecte sub deschiderea grilei împărțit la numărul total de pași parcurși.

Western blot

Efectul Albastru de metilen asupra cascadelor apoptotice și autofagice a fost analizat utilizând western blot. ani timpii au fost sacrificați la 24 de ore după ocluzie. Secțiuni coronale ale creierului (7 felii, 1,5 mm grosime) au fost tăiate și fiecare felie a fost potrivită cu imaginile RMN. Țesutul creierului a fost separat pe bază pe cele trei ROI definite de hărțile ADC și CBF la 30 de minute și T 2 hărți la 24 de ore după accident vascular cerebral. Țesutul colectat de la fiecare ROI a fost omogenizat în tampon rece cu gheață (0,32 M zaharoză, 1 mM EDTA, 1 M Tris-HCL pH = 7,8 şi dH 2 O plus 1 tabletă Roche Protează Inhibitor). Alicote de fiecare fracție a fost utilizată pentru a determina concentrația de proteine din fiecare probă folosind testul proteinei acidului bicinchoninic (BCA) (Thermo Scientific). Probele de proteine (50μg) au fost încărcate pe un gel de poliacrilamidă 12%, electroforezate și transferat pe o membrană de nitroceluloză. Membranele de nitroceluloză au fost apoi blocate, urmată de incubare cu anticorpii primari peste noapte la 4°C și apoi incubată cu anticorpi secundari reciproci la temperatura camerei timp de 2 ore. Anticorpii primari (din Tehnologia de semnalizare celulară, dacă nu se specifică altfel) au fost: i) iepure anti-caspază-3, ii) iepure anti-Bax și Bcl-2, iii) iepure anti-AMPK și β1/2, iv) iepure anti-Phospho-AMPKα (Thr172), v) iepure anti-fosfo-AMPKβ1 (Ser108), vi) iepure anti-total/fosfo-mTOR (Ser2448), viii) iepure anti-total/Phospho-TSC2 (Ser1387), ix) iepure anti-LC3B (din MBL International) și x) iepure anti-p53 (de la MBL International). Diluțiile au fost 1:1000 pt anticorpii primari și 1:2000 pentru anticorpii secundari. Fiecare western blot a fost analizat folosind scanerul C-DiGit Blot (LI-COR Biosciences) și software-ul Image Studio (versiunea 3.1.4).

Analiza statistica

Datele au fost raportate ca medie ± SEM. Testul t pereche a fost utilizat pentru a compara volumul inițial al leziunilor. Umezeala și volumul final al infarctului, iar testul t nepereche a fost utilizat pentru comparații între Albastru de metilen și grupurile de control pentru rezultatele Western blot. p<0,05 a fost considerat ca fiind statistic semnificativ.

Rezultate Rezultatele RMN

Reprezentanți ADC, CBF și T 2 hărți în mai multe momente (30 de minute, 90 de minute și 24 de ore) post-ocluzia de la vehicul și șobolani Albastru de metilen sunt prezentate în Fig 1A. Volumul leziunii ADC la La 30 de minute după ce MCAO a fost similar între grupul vehicul și Albastru de metilen, demonstrând o repro- model MCAO ducibil. T 2 volumul de infarct al grupului de vehicule a fost mai mare decât cel al MB grup la 24 de ore după MCAO. Volumul leziunilor mediate pe grup au fost analizate la 30 de minute, 90 de minute și 24 de ore după accident vascular cerebral (Figura 1B). Volumele inițiale (30 de minute) ale leziunilor definite de ADC înainte de administrarea Albastru de metilen sau vehiculului nu au fost diferite statistic una de alta (161±24mm³ versus 159±13mm³, p>0,05). Volumul leziunilor la 90 de minute a scăzut atât în grupul Albastru de metilen, cât și în grupul vehicul datorită reperfuziei.

Volumul de infarct final dupa 24h al grupului tratat cu Albastru de metilen a fost mai mic decât cel al grupului vehicul (70 ±12 față de 106±14mm³, p<0,05). Pentru a investiga efectele Albastru de metilen asupra CBF asociată cu ischemia cerebrală, CBF al vehiculului cle și grupul Albastru de metilen au fost analizate pentru trei ROI diferite: i) nepotrivirea perfuzie-difuzie salvat prin reperfuzie (ROI-A), ii) nepotrivire nesalvat prin reperfuzie (ROI-B) și iii) miezul ischemic (ROI-C) (Fig 1C). Aceleași ROI au fost folosite pentru toate punctele de timp. Inainte de reper- fuziune (30 minute), valorile CBF ale celor trei ROI nu au fost diferite statistic între ele doua grupuri. După reperfuzie la 90 de minute, valorile CBF atât în ROI-B cât și în C (CBF normalizat: 1,11±0,19 și, respectiv, 1,00±0,12) din grupul Albastru de metilen au fost mai mari decât cele ale vehiculului grup (0,59±0,08 și, respectiv, 0,70±0,11, p<0,05), indicând faptul că Albastru de metilen a crescut CBF după reperfuzie. La 24 de ore, aceleași ROI din grupul Albastru de metilen au arătat mai puțină hiperperfuzie decât cea a grupul de vehicule.

Rezultate comportamentale

Scorurile neurocomportamentale au fost evaluate folosind sistemul de scor Garcia la 24 de ore (Fig 2A). Comparativ cu grupul de control, esantionul a demonstrat scoruri neurocomportamentale mai slabe decât se aștepta. În schimb, grupul tratat cu Albastru de metilen a arătat o îmbunătățire semnificativă statistic a scorurilor neurocomportamentale în comparație cu grupul de control (14,0±0,7 vs. 12,4±0,8, p<0,05). În mod similar, afectarea piciorului – scorurile membrului anterior afectat în grupul Albastru de metilen au fost semnificativ diferite de grupul de control la 2 zile după MCAO (0,13±0,03 vs. 0,46±0,06, p<0,05), dar nu au fost semnificativ diferite ferent înainte de inducerea accidentului vascular cerebral (Fig. 2B). Efectele Albastru de metilen asupra expresiei markerului cheie apoptotic și autofagic Analiza Western blot a fost efectuată pentru a determina raportul de expresie a marcajului autofagiei. (LC3 I și II) și expresia unui marker apoptotic (caspaza-3) la 24 de ore după accident vascular cerebral.

Efectele Albastru de metilen asupra căii apoptotice din aval

Pentru a investiga în continuare efectele Albastru de metilen asupra proceselor apoptotice din aval, p53, Bcl-2 și Bax nivelurile de expresie a proteinei au fost analizate în cele trei ROI (Fig. 4). Media de grup p53 nivelul de expresie în toate ROI-ul grupului de vehicul a crescut semnificativ în comparație cu simularea grup. Grupul Albastru de metilen a arătat niveluri semnificativ reduse de proteină p53 în toate cele trei ROI comparativ la grupul de vehicule (p<0,05). Grupul Albastru de metilen a arătat, de asemenea, o expresie Bax redusă în ROI-A și B, dar nu în ROI-C în comparație cu grupul de vehicule. Albastru de metilen a îmbunătățit, de asemenea, expresia Bcl-2 în ROI-A și B, dar nu în ROI-C comparativ cu vehiculul (p<0,05). În mod colectiv, Albastru de metilen a inhibat cascade moleculare asociate cu calea clasică de semnalizare apoptotică în țesutul cu risc dar nu în miezul ischemic în urma accidentului vascular cerebral ischemic.

Efectele Albastru de metilen asupra căii autofagice din aval

Pentru a investiga în continuare efectele Albastru de metilen asupra inducerii autofagiei, analiza Western blot a fost folosit pentru a determina dacă a existat o legătură între expresia p53 și fosforilare nivelurile de AMPKα/β la locuri specifice pentru cele trei ROI (Fig. 5A). Grupul Albastru de metilen a arătat considerație- hiperfosforilarea capabilă a AMPKα la locul Thr172 în ROI-A și B, dar nu și în ROI-C comparativ cu grupurile simulate și vehicule (p<0,05). În mod similar, grupul Albastru de metilen, de asemenea, demonstrează- a avut o hiperfosforilare considerabilă a AMPKβ1 la locul Ser108, în comparație cu grupuri simulate și vehicule în ROI-A și B (p<0,05), dar nu și în ROI-C. Nivelul de fosforilare al TSC2 (proteina din aval a AMPK) la locul Ser1387 a fost de asemenea măsurat (Fig. 5B). Nivelurile de fosforilare medie de grup ale TSC2 au fost semnificative îmbunătățit de Albastru de metilen atât în ROI-A, cât și în B (p<0,05), dar nu și în ROI-C. Pentru că TSC2 a acționat în jos flux de AMPK pentru a inhiba mTOR [21], nivelul de fosforilare al mTOR la locul Ser2448 ce s-a masurat? În comparație cu simularea, șobolanii tratați cu vehicul au demonstrat o scădere fosforilarea mTOR în ROI-A și B (dar nu ROI-C) și distrugerea șobolanilor tratați cu Albastru de metilen a jucat o reducere suplimentară a fosforilării mTOR în ROI-A și B, dar nu și în ROI-C. Fig. 6 rezumă constatările noastre cu privire la efectele Albastru de metilen asupra autofagiei și apoptozei. MB a crescut procesele autofagice și a inhibat procesele de moarte celulară apoptotică în țesutul cu risc în urma unui accident vascular cerebral ischemic. Acest proces implică calea p53.

Discuţie

Acest studiu a testat mecanismele moleculare care stau la baza neuroprotecției MB Accident vascular cerebral ischemic tranzitoriu la șobolani.

Constatările majore sunt:

1) Albastru de metilen reduce volumul infarctului și deficite comportamentale în urma unui accident vascular cerebral ischemic tranzitoriu la șobolani,

2) Albastru de metilen îmbunătățește CBF la risc țesut după reperfuzie și minimizează hiperperfuzia dăunătoare la 24 de ore după MCAO,

3) MB inhibă apoptoza și îmbunătățește autofagia în țesutul cu risc, dar nu în nucleul ischemic,

4) Albastru de metilen modulează cascada p53-Bax-Bcl2-caspase3, inhibând calea de semnalizare apoptotică- moduri,

5) Albastru de metilen modulează cascadele p53-AMPK-TSC2-mTOR, îmbunătățind semnalizarea autofagică căi.

Avantajul aplicării RMN în cercetarea accidentului vascular cerebral

RMN oferă informații relevante din punct de vedere clinic și este utilizat pe scară largă pentru studiul preclinic și clinic accident vascular cerebral. Imagistica ponderată prin difuzie (DWI) în care contrastul se bazează pe difuzia aparentă a apei coeficientul de sion (ADC) este recunoscut ca o modalitate utilă de imagistică datorită capacității sale de a detecta leziune cerebrală ischemică în câteva minute de la debut [22]. În urma unui accident vascular cerebral ischemic hiperacut, există de obicei un nucleu ischemic și o penumbră ischemică înconjurătoare care s-a redus CBF dar metabolismul energetic conservat [23]. Penumbra ischemică este o țintă importantă pentru tratament. Utilizarea combinată a RMN ADC și CBF permite delimitarea normală, la risc (pen- umbra) și țesuturile centrale ischemice în faza hiperacută [24,25]. S-a folosit RMN multimodal în acest studiu pentru a ghida extracția diferitelor tipuri de țesut pentru analiza ulterioară Western blot sis la animalele individuale. Aceste tipuri de țesut au fost salvate prin nepotrivirea perfuzie-difuzie reperfuzie (ROI-A), nepotrivirea perfuzie-difuzie nesalvată prin reperfuzie (ROI-B), și miezul ischemic (ROI-C), care nu ar fi fost posibil cu histologic terminal analiză [26,27].

În acest studiu, penumbra ischemică a fost aproximată prin greșeala de perfuzie-difuzie. potrivirea și pragurile utilizate pentru definiția nepotrivirii s-au bazat pe stabilite anterior pragurile [19]. Suntem conștienți de faptul că este posibil ca aceste praguri să nu fie aplicate universal tuturor condiţii.condiţii. În plus, studiile clinice care utilizează „nepotrivirea” ca criteriu de selecție pentru tromboliza a avut succes variabil [28–30] și meritul său este încă în dezbatere [31,32]. Altă tehnologie tehnici bazate pe T2’ (T2 cantitativ corectate cu efecte spin-spin, [33]), pH [34] și T2 – imagistica ponderată a provocării cu oxigen [35–37] sunt dezvoltate pentru a îmbunătăți delimitarea penumbra ischemică. Cu toate acestea, utilizarea conceptului de nepotrivire perfuzie-difuzie este Cu toate acestea, utilizarea conceptului de nepotrivire perfuzie-difuzie este utile în studiile noastre. Concluzia noastră generală rămâne valabilă. În ciuda limitărilor sale, parfumul Conceptul de nepotrivire sion-difuzie rămâne util până în prezent din punct de vedere clinic.”

Rolul Albastru de metilen în moartea celulelor apoptotice induse de accident vascular cerebral

În miezul ischemic domină necroza tisulară, în timp ce în penumbră, celula programată căile de moarte, cum ar fi apoptoza [2,3,38] și autofagia [5–7] domină progresia moartea celulelor. Apoptoza poate fi indusă fie de receptorii de moarte de suprafață celulară, fie prin mitocondrii eliberarea citocromului c și multe molecule sunt strâns implicate în reglarea fiecărei coordonate calea identificată. Activarea caspazei-3, un numitor comun atât pentru inducerea apoptozei s-a demonstrat anterior că crește în urma leziunii cerebrale ischemice [39]. Rezultatele au arătat că Albastru de metilen a inhibat expresia caspazei-3 în ROI penumbrei, dar nu și în rentabilitatea investiției de bază. Pentru a investiga în continuare efectul Albastru de metilen asupra căilor apoptotice, doi membri ai celulei B Au fost măsurate proteinele din clasa limfomului: Bcl-2 (anti-apoptotic) și Bax (pro-apoptotic). Noi am constatat că Albastru de metilen a suprimat în mod semnificativ expresia Bax și a reglat în sus nivelurile de proteină Bcl-2 în rentabilitatea investiției penumbra, dar nu în rentabilitatea investiției de bază. În plus, am evaluat expresia p53, cunoscut că declanșează calea apoptotică intrinsecă și a constatat că Albastru de metilen a suprimat și p53 expresie în penumbra ROI. Aceste date sugerează că neuroprotecția Albastru de metilen a acționat prin inhibarea p53 și Bax și îmbunătățirea Bcl-2 pro-supraviețuire. Albastru de metilen inhibă celulele apoptotice moartea prin stabilizarea mitocondriilor, limitând permeabilitatea mitocondriilor exterioare membrana și blocând astfel eliberarea de molecule inductoare pro-apoptotice. Descoperirile noastre sunt în acord cu studiile anterioare în care s-a descoperit că Albastru de metilen stimulează mai multe gene anti-apoptotice și a activat mecanismele de reparare/regenerare a creierului [40,41]. Pe scurt, datele noastre sunt primul pentru a demonstra că Albastru de metilen inhibă calea apoptotică p53-Bax-Bcl2-caspaze3, suprimă- provocând moartea celulelor apoptotice în ROI penumbral, prevenind astfel tranziția în infarct și scăderea volumului total al infarctului. MB are efecte similare atât în ROI-A cât și în ROI-B (ambele ROI au fost clasificate ca perfuzie- nepotrivire de difuzie), în timp ce țesutul din ROI A a supraviețuit, dar țesutul din ROI B a murit. Arată expresia Caspazei-3 în ROI-B a grupului Albastru de metilen decedat semnificativ. Cu toate acestea, expresia Caspazei-3 în regiunea ROI-B a Albastru de metilen grupul era încă la același nivel cu regiunea ROI-A a grupului de vehicule. Aceasta indică faptul că Chiar dacă tratamentul cu Albastru de metilen reduce parțial procesul apoptotic, recuperarea a fost insuficientă cient pentru a salva țesutul din ROI-B. În plus, am găsit și o diferență semnificativă între grupurile Sham și Albastru de metilen din regiunea ROI-B, dar nu și în regiunea ROI-A, care indică faptul că nivelul apoptotic a revenit la normal în regiunea ROI-A. Rolul Albastru de metilen în moartea celulelor autofagice induse de accident vascular cerebral Autofagia este un proces extrem de reglementat care descompune organele și macromoleculele prin degradare lizozomală și este esențială pentru menținerea homeostaziei intracelulare. Autofagia joacă un rol important în salvarea țesutului cu risc din penumbra în perioada acută faza, precum și în îmbunătățirea recuperării funcționale în faza cronică. Hiperactivarea autofagia, totuși, poate duce la creșterea morții celulare. Autofagia este astfel considerată o sabie cu doua taisuri. Autofagozomii se formează în timpul autofagiei ca mecanism de eliberare a sechestrate resturile celulare la lizozomi pentru degradare. Până în prezent, LC3, un omolog de mamifer al drojdiei Atg8, este singurul marker de încredere pentru autofagozomi, deoarece este o componentă specifică a autofagozomilor membrana hagozomală [42]. LC3 începe ca LC3-I citoplasmatic și este recrutat la autofa- gosome în timpul autofagiei, în timp ce LC3-II este generat ulterior prin proteoliză și lipidare [43]. Urmărirea conversiei LC3-I la LC3-II prin imunoblot oferă a măsurarea activității autofagice [5]. Rezultatele noastre au arătat că raportul LC3-II la LC3-I a crescut în toate cele trei ROI din grupul vehicul și Albastru de metilen comparativ cu grupul simulator. Cu toate acestea, numai țesutul cu risc a prezentat un raport LC3-II la LC3-1 crescut cu Albastru de metilen comparativ cu vehiculul grup. Studiile anterioare au demonstrat că clorochina (cunoscută că blochează autofagia) inhibă neuroprotecția mediată de Albastru de metilen [44]. Pe scurt, am ajuns la concluzia că neuroprotectorul efectul Albastru de metilen este mediat de autofagia de reglare în sus numai în regiunea penumbrei, dar nu și în miezul ischemiei. Reglarea autofagiei este strâns legată de căile de semnalizare care promovează celulele proliferarea și semnalizarea nutrienților (adică mTOR, p53/AMPK și PI3-K). Datele noastre acceptă ipoteza că Albastru de metilen activează autofagia prin calea de semnalizare p53-AMPK-mTOR. The AMPKα (la situl Thr172) și AMPKβ1 (la situl Ser108) s-au dovedit a fi hiperfosforilat, în concordanță cu un studiu anterior care a demonstrat că activarea AMPK indusă de Albastru de metilen a fost însoțită afectat de promovarea acetil-CoA carboxilază, care este o proteină în aval de AMPK (Xie et al., 2013). Mai mult, am descoperit că mTOR (la locul Ser2448) a fost hipofosforilat în țesuturile nepotrivite ale grupului Albastru de metilen. Această constatare este în concordanță cu un studiu anterior care a raportat că Albastru de metilen induce autofagie prin inhibarea activării mTOR în neurodegenerative linii celulare transgenice [45]. Există mai mulți factori de reglementare care controlează activitatea mTOR care în cele din urmă influențează nivelul de activare al autofagiei. Dacă Albastru de metilen acționează prin căile mTOR rămâne însă controversat [44,45]. Astfel, am testat mecanismele moleculare ale căii AMPK din aval. mod. Calea AMPK joacă un rol cheie în controlul metabolismului celular și al energiei homeostazie [7,21]. AMPK este cunoscut că fosforilează și crește TSC2, care inhibă Calea mTOR, promovând autofagia [7,21]. Am descoperit că TSC2 a fost într-adevăr hiperfosforilat la locul Ser1387 în grupul tratat cu Albastru de metilen, susținând ideea că Albastru de metilen acționează prin calea AMPK și mTOR în reglarea autofagiei. În plus, această fosforilare a fost mai mare în ROI-A decât în ROI-B, ceea ce indică amploarea diferită a autopării în aval inducție hagy între țesutul cu risc salvat față de cel nesalvat. Luați împreună, noi am ajuns la concluzia că autofagia indusă de Albastru de metilen este mediată de inhibarea p53, care ulterior activează AMPK determinând inhibarea mTOR în zona penumbrală. Datele noastre au indicat că Albastru de metilen acționează asupra apoptozei și autofagiei prin modularea activului p53. Se știe că moartea celulelor apoptotice indusă de p53 are loc prin reglarea expresiei genelor și promovarea integrității membranei mitocondriale [46]. În timpul hipoxiei, p53 nuclear se reduce autofagie prin suprimarea expresiei BNIP3 [47]. În schimb, inhibarea citoplasmatică p53 poate declanșa autofagia [48]. Datele noastre au arătat că Albastru de metilen acționează probabil pentru a suprima ambele nucleare și p53 citoplasmatică, inhibând calea apoptotică p53-Bax-Bcl2-caspase3 în timp ce intensifică în calea de semnalizare autofagică p53-AMPK-TSC2-mTOR. La nivel sistemic, s-a demonstrat că Albastru de metilen crește CBF, glucoza din creier și concentrația de oxigen. consumul în condiții normoxice și hipoxice [49], precum și îmbunătățirea răspunsurilor evocate datorită stimulării labei anterioare [50]. Am descoperit că Albastru de metilen a îmbunătățit CBF la țesutul cu risc post- reperfuzie. În plus, am găsit, de asemenea, hiperperfuzie dăunătoare minimizată de Albastru de metilen la 24 de ore după MCAO, despre care s-a demonstrat anterior că se corelează cu un rezultat slab în accidentul vascular cerebral ischemic [51]. S-a demonstrat, de asemenea, că Albastru de metilen scade producția de specii reactive de oxigen în ischemie/reper- leziuni de fuziune [52] și moartea celulelor neuronale induse de stresul oxidativ [53]. Îmbunătățirea producția de energie și reducerea radicalilor liberi de oxigen contribuie probabil la stabilizare a mitocondriilor și neuroprotecția ulterioară în timpul accidentului vascular cerebral ischemic tranzitoriu. MB are un profil de siguranță excelent și este utilizat clinic pentru a trata o serie de indicații, permițând traducerea rapidă în studiile clinice, dacă se dovedește a fi eficace la animalele cu accident vascular cerebral. Îmbunătățirea înțelegerii mecanismelor care stau la baza neuroprotecției Albastru de metilen după accident vascular cerebral in vivo va ajuta la o mai bună proiectare a studiilor clinice Albastru de metilen și a schemelor de tratament cu Albastru de metilen pentru accident vascular cerebral pacientii in viitor. Un avantaj unic al Albastru de metilen este că, în principiu, ar putea fi administrat la fața locului de către personalul care răspunde de urgență, ceea ce ar putea beneficia de un pacient mai mare cu accident vascular cerebral acut in populatie.

Concluzie

Acest studiu a demonstrat că neuroprotecția indusă de Albastru de metilen în accidentul vascular cerebral ischemic este mediată de intensificarea autofagiei și suprimarea apoptozei. RMN-ul multimodal a permis extragerea diferite tipuri de țesut pentru analiza Western blot, iar aceste tipuri de țesut au inclus perfuzia nepotrivire de difuzie (țesut la risc) salvat prin reperfuzie, nepotrivirea perfuzie-difuzie nesalvat prin reperfuzie, iar miezul ischemic. Datele noastre au arătat că Albastru de metilen a modulat p53 expresie, care, la rândul său, a modulat atât calea de semnalizare autofagică AMPK-TSC2-mTOR- calea și calea de semnalizare apoptotică Bax-Bcl2-caspase3. Gradul de autofagie și apoptoza diferă între diferitele țesuturi ischemice definite de RMN și între vehicul și grupuri Albastru de metilen. Acest studiu zdrobește mecanismele moleculare care stau la baza neuroprotectiei in AVC ischemic.

Contribuții ale autorului

A conceput și proiectat experimentele: ZJ TD. Au efectuat experimentele: ZJ SH QS PR. S-au analizat datele: ZJ SH QS. Reactivi/materiale/instrumente de analiză contribuite: TD. Scrieți hârtie: ZJ TD LW CC CZ.

0 notes