#DNA Sekanslama Yöntemleri

[bilimveteknoo]

https://www.bilimvetekno.com/dna-sekanslama-dizileme-yontemleri/

DNA Sekanslama (Dizileme) Yöntemleri

DNA sekanslama bir genomdaki (DNA’daki) nükleotit bazlarının (Adenin, Guanin, Sitozin ve Timin) sırasının belirlenmesidir. İlk büyük başarısını proteinlerin kimyasal yapısını ortaya çıkaran teknikler geliştirip 1958 yılında Kimya Nobel Ödülü’nü alan Frederick Sanger, bu başarısının ardından DNA ile ilgilenmeye başlamış ve bir virüsün genom dizisini ortaya çıkarmıştır. Kendi adıyla anılan (Sanger Dizileme) yöntem ile de 1980’de bir kez daha Kimya Nobel Ödülü’ne layık görülmüştür.

Günümüz Sekanslama Yöntemleri

Sanger Sekans Analizi Frederick Sanger ve arkadaşları tarafından 1977 yılında geliştirildi. ‘Applied Biosystems’ adlı şirket tarafından piyasaya sürüldü. İn vitro DNA replikasyonu sırasında, DNA Polimeraz enzimi tarafından zincir oluşumunu sonlandıran di deoksinükleotitlerin eklenmesi yöntemine dayanır.Reaksiyon tüpleri ayrı ayrı Jel Elektroforezi ile yürütülür. Jeller görüntülenir.  Her bir band, farklı uzunluklardaki DNA fragmentlerini gösterir. ddNTP eklendiği  zaman reaksiyon durur ve o uzunlukta DNA elde edilir.

Pirosekanslama Real time DNA sekanslama analizi. DNA polimeraz yeni DNA’yı ürettikçe, enzimin hangi bazı eklediğinin tespitine dayalı bir yöntemdir. DNA polimeraz, Sülfirilaz, Lusiferaz enzimleri kullanılır. Yeni oluşan DNA’ya dNTP’ler sırayla eklenir ve hangisi DNA kalıbındakiyle eşleşirse pirofosfatı (PPi) salınır. Sülfirilaz enzimi, Pirofosfatı ATP’ye dönüştürür. Lüsiferaz enzimi, oluşan ATP’yi kullanarak Lüsiferin adlı bileşiği Oksilüsiferin bileşiğine dönüştürür ve Oksilüsiferin de ışık yayar.

Illumina Sekanslaması Pirosekanslama yöntemine dayanır. 3 temel aşaması vardır: Çoğaltma, sekanslama, analiz etme. Saflaştırılan DNA, küçük parçalara ayrılır ve adaptör DNA parçaları eklenir. Özel çiplere aktarılır, burada çoğaltılır ve sekanslanır. Otomatik olarak makinalarda yapılır.

ROCHE 454 Sekanslaması Pirosekanslama yöntemine dayanır. 400-600 Mb sekanslama kapasitesine sahiptir. Adaptöre bağlanmış DNA’lar, su-yağ karışımlarındaki çok küçük boncuk yapılara eklenir. Sonrasında ise DNA’lar çoğaltılır ve sekanslanır.

Life Technologies Solid ‘Support Oligonucleotide Ligation Detection’ Ligasyon (Bağlama) ile Sekanslama yöntemine dayanır. Polimeraz yerine ligaz enzimi kullanılır. DNA yeniden üretilmez, onun yerine daha önceden üretilmiş oligonükleotitler dizi sırasına uygun olarak birbirine bağlanır.

Life Technologies Ion Torrent İyon yarı iletken dizilemesi. DNA’nın oluşumu sırasında açığa çıkan hidrojen iyonlarının tespitine dayalı bir yöntemdir. Sekanslanacak DNA ipliği içeren bir mikrokuyu, tek bir nükleotit tipi ile doldurulur.

Pacific Biosciences ve 3. Nesil Sekanslama Tek Molekül Gerçek Zamanlı Sekanslama. Sıfır mod dalga alanı (zero-mode waveguide ZMW) olarak adlandırılan, optik kuyucuk tabanına tek bir DNA polimeraz bağlanmıştır. Her bir nükleotit tipi farklı bir floresan molekülüyle etiketlenmiştir. Hangi nükleotit eklendiyse, ondan salınan floresan molekül difüzyonla kuyucuktan çıkar ve algılanır.

Kaynak >>> https://www.bilimvetekno.com/dna-sekanslama-dizileme-yontemleri/